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王勇研究組在大腸桿菌中實(shí)現了(S)-四氫小檗堿的高效從頭合成

4月19日,國際學(xué)術(shù)期刊ACS Sustainable Chemistry & Engineering在線(xiàn)發(fā)表了中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng )新中心王勇研究組完成的題為“Design and optimization for efficient production of (S)-canadine in?Escherichia coli的研究論文。該研究首次實(shí)現了(S)-四氫小檗堿在大腸桿菌中的高效合成,為手性藥物的微生物合成提供了參考。

(S)-四氫小檗堿是一種具備降糖、降脂和抗氧化等多種活性的原小檗堿類(lèi)化合物,也是合成小檗堿(抗菌藥)和諾斯卡品(抗腫瘤藥)的關(guān)鍵前體,在藥物研發(fā)方面具有巨大的潛力。現階段,(S)-四氫小檗堿可通過(guò)植物提取或化學(xué)半合成的方式獲得。然而,毛茛目植物根莖中(S)-四氫小檗堿的含量低以及化學(xué)合成的立體選擇性差等因素,限制了其大規模生產(chǎn)。微生物制造在手性化合物的合成方面獨具優(yōu)勢,是合成此類(lèi)高價(jià)值產(chǎn)品的重要技術(shù)手段。目前,微生物體系中已能高效合成芐基異喹啉生物堿的共同前體(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿,但是受限于部分膜蛋白的非功能性表達,還未能實(shí)現(S)-四氫小檗堿的高效率從頭合成。

本研究首先利用CRISPR-Cas9技術(shù)構建了一個(gè)高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌底盤(pán)SQZB18,搖瓶培養2天后可積累2.11 g/L的酪氨酸(圖1)。隨后,研究者發(fā)現四氫生物喋呤循環(huán)途徑整合至基因組前后,過(guò)表達大鼠和果蠅來(lái)源酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase, TYH)的菌株中(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿的合成趨勢發(fā)生逆轉。結合酪胺的結構特征及體內飼喂實(shí)驗的結果,推測并證實(shí)了酪胺對RnTYHWR的抑制作用(圖2)。研究者后續巧妙地利用EcHpaBC-D11將酪胺轉化為多巴胺,解除了酪胺的抑制作用,并通過(guò)過(guò)表達嘌呤核酸磷酸化酶,獲得了菌株SQZ227,經(jīng)兩天的搖瓶培養能產(chǎn)生100.13 mg/L(S)-網(wǎng)狀番荔枝堿(圖3)。為了克服小檗堿橋酶(Berberine bridge enzyme, BBE)和四氫小檗堿合成酶(Canadine synthase, CAS)功能性表達的難題,研究者將篩選到的薊罌粟(Argemone mexicana L.)來(lái)源的小檗堿橋酶(AmBBE1)進(jìn)行同源建模和分子對接,得到98%轉化率的突變體AmBBE1F398W-I431F;另外,在優(yōu)化CAS可溶性表達的基礎上,借助蛋白-肽相互作用結構域(SH3)和其配體(SH3-lig),最終從不同CAS來(lái)源的組合中篩選到支架結構的trCjCAS-AtCPR2,體外條件下能將32%的底物轉化為小檗堿(圖4)。在此基礎上,結合改善膜蛋白表達效率的效應因子(RraA)和細胞色素b5,研究者得到了表現最佳的(S)-四氫小檗堿產(chǎn)生菌SQZ266,該菌株在搖瓶培養下的產(chǎn)量達到16.81 mg/L,在反應器發(fā)酵條件下產(chǎn)量達到165.74 mg/L(圖5),是目前報道微生物從頭合成原小檗堿的最高水平。該研究不僅提供了生物堿高效微生物底盤(pán)的設計思路,也為生物堿的綠色和可持續生產(chǎn)奠定了基礎。

中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng )新中心王勇研究組博士研究生張前為論文的第一作者,王勇研究組的博士研究生吳宇函參與了相關(guān)工作。該研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、上海市學(xué)術(shù)帶頭人計劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院先導項目及植物分子遺傳國家重點(diǎn)實(shí)驗室的資助。

論文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.3c08493

在大腸桿菌中實(shí)現了(S)-四氫小檗堿的高效從頭合成